近日，四川大学华西医院肺移植研究室在《Signal Transduction and Targeted Therapy》（IF: 81.2,新锐分区一区，Top期刊）发表了文章：An integrated multiomic single-vesicle atlas delineates graft exosome heterogeneity in chronic lung allograft dysfunction。
外泌体在慢性肺移植功能障碍（Chronic Lung Allograft Dysfunction, CLAD）中的作用机制尚不明确，核心瓶颈在于 CLAD 状态下外泌体存在显著的功能异质性。本研究首次系统解析 CLAD 移植肺组织外泌体(Extracellular Vesicles, EV)异质性。借助邻近条形码分析（Proximity Barcoding Assay，PBA）单囊泡膜蛋白组，鉴定出参与慢性排斥（Chronic Rejection, CR）的 14 种移植肺外泌体亚群；结合病理分级、单囊泡蛋白组、组织bulk蛋白组、组织bulk代谢组解析不同亚群在 CLAD 的病理贡献。其中 C1、C2、C4 主要促纤维化；C5、C12、C13 更多参与免疫炎症应答。C12（Ilk-high）外泌体的丰度下降在 RAS 患者血浆得到验证，构建 C12 EV亚群调控胸膜增厚的核心分子网络。总之，本研究绘制移植肺组织外泌体异质性图谱，加深对外泌体在 CLAD 中作用的理解，推动外泌体在 CLAD 领域转化应用。恩泽康泰提供了大鼠移植肺组织EV 分离表征 &PBA单囊泡膜蛋白质组服务。
研究背景
慢性肺移植功能障碍（CLAD）是限制肺移植受者长期生存的主要并发症，其发病机制尚未明确，临床缺乏有效治疗手段。细胞外囊泡（EV）参与移植肺免疫应答、组织重塑及损伤修复，但其高度异质性制约了亚群功能与作用机制的解析。
本研究拟利用PBA单囊泡膜蛋白质组技术，解析大鼠慢性排斥（CR）肺移植模型中的EV亚群，并结合移植肺组织bulk多组学，揭示不同亚群参与CLAD发生发展的潜在机制，为疾病机制研究与靶向干预提供新思路。
研究方法
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大鼠慢性排斥CR模型构建和表型确认：Lewis、Brown‑Norway 雄性近交系大鼠，体重 250‑300g。同基因组 Syn：BN→BN 原位左肺移植；CR 组：MHC 错配 BN→Lewis 肺移植。移植术后第 1 周环孢素 A CsA 给药，每周 4 次；全部大鼠移植后 4 周终点处死。组织病理学评估：HE、Masson 三色、天狼星红染色；按照 ISHLT 标准评估 A/B 排斥分级；参考 Martinu 方案半定量血管内皮炎、血管纤维化、气道周围纤维化、闭塞气道纤维化、上皮增生扁平；统计闭塞细支气管占比 OB%；ImageJ 定量肺实质纤维化百分比；HE 切片测量胸膜厚度；双盲病理读片。
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组织EV提取和表征：冻存的移植肺组织，冰冻切片，酶解透化，差速超离离心+排阻SEC+超滤提取组织EV，并进行电镜TEM、nanoFCM粒径/颗粒浓度检测、WB检测EV阳性和阴性marker蛋白。
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组织EV PBA单囊泡膜蛋白质组：移植肺组织EV进行PBA检测分析，ExoSeek260 panel，FlowSOM算法分析EV亚群，结合 CellMarker、ProteinAtlas 数据库和各EV亚群top蛋白溯源各EV亚群的细胞来源。进行EV亚群间相关性分析，以及EV亚群丰度或细胞来源EV亚群丰度和组织病理指标相关性分析。
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组织bulk多组学：移植肺组织同时开展total蛋白质组-DIA和非靶代谢组。
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WGCNA分析：对蛋白矩阵、代谢物矩阵构建加权共表达模块，筛选与纤维化等病理指标相关的蛋白模块或代谢物模块。
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多组学关联分析：计算14个EV亚群占比、蛋白表达、代谢物丰度、免疫细胞比例、病理指标两两之间相关性；计算平均绝对相关系数 |r|。
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临床患者筛选与样本收集：202512至202602无锡市人民医院随访肺移植患者，收集血浆样本；5例限制性移植体综合征（Restrictive Allograft Syndrome, RAS）患者（FEV1下降至基线80%以下，TLC下降至基线90%以下，影像存在间质性肺病改变）；5例移植时间匹配病情稳定对照，全部为双肺移植。
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血浆EV ELISA检测：提取血浆EV，用人 ILK、MRC1、NT5E的ELISA商品化试剂盒，检测血浆囊泡膜蛋白表达。
主要研究结果
1. 大鼠慢性排斥CR模型组织病理学评估
实验分为同基因移植组 Syn（n=6）、慢性排斥 CR 组（n=9）。图 1a 展示造模流程、标本以及 HE、Masson 三色、天狼星红染色病理结果。同基因移植组Syn：细支气管结构完整，假复层上皮排列完好，肺泡、血管形态正常。CR 组：肺组织体积缩小，肺表面光滑、弹性差，整体呈浅棕褐色；镜下肺泡、肺泡囊、肺泡管、肺泡隔、细支气管结构破坏肿胀；血管、细支气管周围大量免疫细胞浸润。Masson、天狼星红染色可见典型 CLAD 病理改变：闭塞性细支气管炎、纤维化向细支气管和血管周围蔓延、广泛胸膜及胸膜下纤维化。
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2. 移植肺组织来源EV定量与表征
取 Syn 组 3 只、CR 组全部 9 只大鼠的移植肺组织提取EV。纳米流式 NanoFCM 检测粒径与颗粒浓度：两组EV平均粒径相近；但是同基因组Syn每克肺组织EV颗粒数显著高于CR组。透射电镜 TEM 观察到两组EV均呈现典型杯状囊泡形态。Western blot 检测标志物：EV标志物 TSG101、Alix、HSP70 阳性表达；内质网标志物 Calnexin 阴性，证明样本EV制备合格。
图1-2 移植肺组织EV表征
3. CLAD移植肺中14个基于膜蛋白特征的EV亚群
基于单囊泡膜蛋白表达模式，将全部外泌体分为14个亚群（图2a t‑SNE图）。与 Syn 相比，CR 组 7、13、14 亚群丰度显著下降；2、4 亚群丰度显著上升（图2b）。
图2-1 移植肺组织EV PBA单囊泡膜蛋白质组EV亚群分析
表1 移植肺组织EV亚群来源细胞推测
表1汇总每个亚群最高表达膜蛋白以及推测细胞来源。细胞来源分析：CR 组上皮细胞、平滑肌细胞来源外泌体丰度显著下降；T 细胞、B 细胞、中性粒细胞来源外泌体丰度显著升高（图 2c）。
CR 组样本相关性分析：亚群1丰度和肺实质纤维化百分比最强正相关（r=0.95，P<0.001）；亚群12（Ilk 高表达）丰度与胸膜厚度呈最强负相关（r=-0.90，P<0.001）（图 2d）。上皮来源EV丰度与实质纤维化指标具有最强正相关性；T 细胞来源EV丰度与血管内皮炎症具有最强负相关性（图 2e）。
图2-2 各EV亚群和细胞来源EV丰度与组织病理指标相关性
4. 14个EV亚群对CLAD发生的蛋白分子贡献
对移植肺组织bulk蛋白质组检测：CR组与Syn组一共鉴定2283个差异蛋白，892个上调，1391个下调(图3 a-b)，构建差异蛋白互作网络。CR组上调蛋白富集最显著通路为补体和凝血级联反应；下调蛋白最显著富集为紧密连接通路(图3 d)。
组织EV PBA单囊泡与组织bulk蛋白质组关联分析：计算每个EV亚群丰度和组织差异蛋白表达相关性，将满足r>0.7且P<0.05的蛋白定义为该EV亚群相关差异蛋白(图3 c)。
显著相关差异蛋白数量排名前三的亚群：cluster12、cluster4、cluster2。cluster12相关差异蛋白富集：Rap1 信号通路、补体凝血级联、白细胞跨内皮迁移、肾素‑血管紧张素系统；cluster4 关联蛋白富集：神经活性配体‑受体相互作用、补体凝血级联、赖氨酸降解；cluster2相关差异蛋白富集：神经活性配体‑受体相互作用、补体凝血级联、谷胱甘肽代谢(图3 e)。不同细胞来源EV关联蛋白富集：巨噬细胞来源→补体凝血级联；内皮细胞来源→吞噬体；T 细胞来源→蛋白质消化吸收；B 细胞来源→补体凝血级联；上皮来源→肾素‑血管紧张素系统。GSEA 显示 CR 组显著富集免疫应答(与亚群1, 2, 4, 5, 8, 12和13显著相关蛋白)、抗原加工提呈通路(与亚群3, 8和12显著相关蛋白)。
基于蛋白质组反卷积免疫细胞：CR组浆细胞、活化记忆CD4 T细胞、滤泡辅助T细胞、活化NK细胞、M2巨噬细胞、静息肥大细胞、中性粒细胞数量上升；静息记忆CD4T、静息NK、单核细胞、静息树突细胞、活化肥大细胞、嗜酸性粒细胞数量下降。cluster12、T 细胞来源EV与活化NK细胞相关性最高；免疫细胞来源EV中，T细胞来源EV膜蛋白异质性最高。
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5. 14个EV亚群在CLAD中的代谢层面贡献
移植肺组织bulk非靶向代谢组共鉴定得到277个差异代谢物，多数参与脂质代谢（甘油磷脂代谢）(图4 a-b)。VIP排名前3：六氢姜黄素、三七皂苷C、SM (d18:1/PGE2) (图4 c)。差异代谢物富集 FcεRI 信号通路（丰度下降），甘油磷脂代谢通路（丰度上升）(图4 d)。iPath 分析提示CR组脂质、能量、碳水化合物代谢发生明显扰动。
组织bulk蛋白质组&代谢组关联分析：差异蛋白‑差异代谢物共同富集通路包括FcεRI信号通路。差异代谢物‑免疫细胞比例(蛋白质组反卷积)相关性：plazomicin与M2巨噬细胞比例强正相关；环巴胺与γδT细胞比例强负相关。
组织EV PBA单囊泡与组织非靶代谢组关联分析：计算各EV亚群丰度与差异代谢物相关性，P<0.05定义为关联代谢物(图4 e)。关联差异代谢物数量 top3：cluster12、cluster2、cluster9。cluster12关联代谢物：甘油磷脂代谢、自噬；cluster2关联代谢物：甘油磷脂代谢、NF‑κB信号通路；cluster9关联代谢物：逆行内大麻素信号通路。不同细胞来源EV代谢富集：T 细胞来源→Th1/Th2分化；上皮来源→NF‑κB；B 细胞来源→FcεRI；巨噬细胞→NF‑κB；内皮细胞→甘油磷脂代谢(图4 f)。
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6. 两组功能拮抗EV亚群对CLAD的作用
根据病理指标相关性，分为两组功能类别：①促纤维化EV亚群（C1、C2、C4、C9），丰度与纤维化病理指标正相关，与炎症免疫指标负相关；②抗纤维化/促免疫炎症EV亚群（C5、C12、C13），与病理指标呈现完全相反的相关性趋势。(图2 d)
丰度相关性分析：C1/C2/C4与C5/C12/C13之间丰度显著负相关，提示二者拮抗关系；C9和其他亚群相关性不显著(图5 a)。膜蛋白表达模式提示C1与C2蛋白谱较为接近(图5 b)。对两组拮抗EV亚群共同关联的差异分子富集分析，富集通路包括神经活性配体受体互作、中性粒细胞胞外诱捕网NET形成、Rap1信号通路(图5 c)。
蛋白组、代谢组WGCNA分析：PRO‑MEblue模块蛋白、MET‑MEblue代谢模块与纤维化指数最强正相关；PRO‑MEturquoise、MET‑MEred模块与纤维化指数最强负相关。
PBA与蛋白/代谢多组学整合分析：取两组拮抗EV亚群关联分子和 WGCNA 关键纤维化相关蛋白模块/代谢物模块分子交集做富集（图5 f,h）：C1/C2/C4与PRO‑MEblue、 PRO‑MEturquoise模块交集蛋白显著富集：补体凝血级联；C5/C12/C13与PRO‑MEblue、 PRO‑MEturquoise模块交集蛋白显著富集：血管平滑肌收缩、白细胞跨内皮迁移； C1/C2/C4与MET‑MEblue、MET‑Mered模块交集代谢物显著富集：甘油磷脂代谢、逆行内大麻素信号；C5/C12/C13与MET‑MEblue、MET‑Mered模块交集代谢物显著富集：胆固醇代谢、TRP 通道炎症介质调节。
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7. Ilk高表达EV亚群（cluster12）在RAS中的验证与多重作用机制
大鼠模型病理特征偏向RAS，而C12与RAS标志性病变胸膜厚度强负相关，因此开展临床样本验证。入组10例肺移植患者：5例RAS患者，5例移植后病情稳定对照。纳米流式检测两组总EV颗粒总数无统计学差异；ELISA 检测囊泡表面膜蛋白： RAS患者每个囊泡上Ilk蛋白表达水平显著低于稳定组；Mrc1（C1 EV亚群marker）、Nt5e（C4 EV亚群marker）无组间差异。证实临床 RAS 患者样本中C12 EV亚群（Ilk高表达）显著下降，和动物模型一致。
整合EV亚群丰度、病理、蛋白、免疫细胞、代谢物多组学关联结果，筛选同时和C12 丰度、胸膜厚度高度相关的top100蛋白、代谢物，构建蛋白‑蛋白互作核心网络。网络核心分子包括：能量代谢分子Aco2；免疫因子Cfd、Gzma、C5ar1、Cxcl12；ECM纤维化核心分子Col1a1、Col5a2；血管调控分子Plxdc2、Timp2。
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研究结论
本研究首次系统解析CLAD移植肺组织EV异质性。借助PBA单囊泡膜蛋白组，鉴定出参与慢性排斥CR的14种移植肺组织EV亚群；结合病理指标、PBA单囊泡蛋白组、组织bulk蛋白组、代谢组解析不同亚群在CLAD的病理贡献。其中EV亚群C1、C2、C4 主要促纤维化；C5、C12、C13 更多参与免疫炎症应答。亚群C12（Ilk-high）的丰度下降在 RAS 患者血浆得到验证，构建C12调控胸膜增厚的核心分子网络。总之，本研究绘制了移植肺组织EV异质性图谱，加深了EV在CLAD中作用的理解，推动EV在CLAD领域转化应用。
论文引用：
Tian D, Zheng X, Yu Z, et al. An integrated multiomic single-vesicle atlas delineates graft exosome heterogeneity in chronic lung allograft dysfunction. Signal Transduct Target Ther. 2026;11(1):389. doi:10.1038/s41392-026-02927-7
1、本研究是“组织EV PBA单囊泡膜蛋白质组鉴定关键EV亚群+组织蛋白质组/代谢组多组学整合关联分析”的典型案例。
2、适合对PBA单囊泡膜蛋白质组新技术感兴趣想开展类似研究的老师同学借鉴，尤其是您所研究领域还未有PBA技术应用时，抓紧时间上PBA新技术直通车！
3、适合已经做了/正在做PBA单囊泡膜蛋白质组，但不知道如何解析PBA鉴定到的EV亚群功能/分子机制的老师们借鉴。
4、做了PBA单囊泡膜蛋白质组和EV bulk蛋白质组/代谢组等多组学分析的老师们，可以主要借鉴多组学整合分析思路。
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