随着技术和仪器硬件平台等升级，外泌体蛋白质组研究已经迈入微量化、高纯度、质价比、千蛋白时代！恩泽康泰Exoomics®超微量外泌体蛋白质组平台，致力让研究者能够以微量样本得到高纯度外泌体，以极高质价比、微量外泌体蛋白开展外泌体蛋白质组研究，获得数千高质量蛋白，详见《超微量外泌体蛋白质组突破用量极限和检测上限-低至200μL血浆！高达4000+ EV蛋白！》《藏不住了，压心底的小"奥泌"|新品速递》。
外泌体常规蛋白质组技术能够提供外泌体/细胞外囊泡EV蛋白组成及相对丰度信息，已帮助科研工作者解决了外泌体蛋白内容解析、潜在功能蛋白筛选、疾病标志物初筛等基础科研问题。
但目前外泌体蛋白质组研究备受青睐，内卷态势明显！同时也存在一些问题：
蛋白翻译后修饰水平的变化，可能在总蛋白丰度未明显改变的情况下影响其活性、稳定性、亚细胞定位、相互作用或降解命运，仅做常规蛋白组可能会遗漏关键信息！
仅基于蛋白表达水平差异，有时筛选到的差异蛋白有限、整体丰度变化不显著，导致后续验证和转化推进困难！（与来源细胞或组织的整体蛋白组相比，EV蛋白组具有选择性装载和有限载量的特点，其可检测蛋白谱通常更受样本量和检测深度限制）
常规蛋白质组能锁定信号通路，但不能获得由特定位点修饰驱动的蛋白活化、复合物组装、降解调控及信号时序变化，而这恰恰是很多高水平文章出彩的地方。
破解上述困境的关键，就是蛋白质翻译后修饰（Posttranslational modifications, PTM）。PTM是蛋白质在翻译完成后发生的共价化学修饰，包括磷酸化、糖基化、乙酰化、泛素化、乳酰化、脂质化等。不同PTM可调控蛋白活性、构象、稳定性、亚细胞定位、蛋白互作及降解过程，是连接基因表达与细胞功能状态的重要调控层。PTM广泛参与信号转导、代谢重编程、免疫调控、蛋白质稳态及染色质调控等过程。基于质谱的蛋白质组学，极大推进了学界对于翻译后修饰分布特征与动态变化规律的认知。
图1：常见蛋白翻译后修饰类型
外泌体形成、发挥功能的全程，其内部蛋白会发生丰富的翻译后修饰。但目前绝大多数外泌 体研究只做总蛋白组，修饰层面的深挖十分稀缺，不少老师会产生这些困惑：
篇幅所限，本期恩博将一些经典文献融合在前3个问题中精简展示，最后一个问题后续会为大家精选近期高水平文献一一解读。
在部分疾病场景中，体液EV中一些蛋白的总丰度在健康人与患者之间差异有限，且易受个体差异、采样时间、疾病分期及共分离背景等因素影响，因此仅依赖总蛋白丰度可能难以构建稳定、高性能的诊断模型。
某些特定位点的翻译后修饰（PTM）可更直接反映疾病相关信号通路、代谢状态或蛋白功能状态的变化；在部分情况下，其变化幅度或疾病相关性可能高于总蛋白丰度，呈现更显著的变化，为解析信号通路活化状态和发现候选标志物提供更丰富的信息！因此，PTM位点有望提升液体活检候选标志物的特异性、疾病分层能力或早期检出性能。
研究发表，血浆样本存放时长超过5年，包裹在外泌体内部的磷酸化蛋白具备优异的储存稳定性（Proc Natl Acad Sci U S A. 2017;114(12):3175-3180.），表明深入分析血浆外泌体磷酸化、糖基化等修饰蛋白质组，从中筛选疾病标志物具备较高可行性。
图2：乳腺癌患者与健康对照血浆细胞外囊泡EV磷酸化蛋白质组分析实验流程
——Proc Natl Acad Sci U S A. 2017;114(12):3175-3180.
图3：外泌体糖基化修饰PD-L1作为潜在肿瘤诊断标志物
——Small Methods. 2022 Sep;6(9):e2200549.
部分疾病相关蛋白的功能依赖于特定PTM状态。识别关键修饰位点及其上游调控酶、下游识别蛋白，或由修饰诱导形成的蛋白构象与相互作用界面，可为疾病机制解析、精准药物靶点发现及药效标志物开发提供依据。
针对性改变外泌体的糖基化等修饰水平，可拓展其在靶向治疗层面的应用潜力。
图4：通过表面糖被工程化改造实现EV的细胞特异性靶向
——J Extracell Vesicles. 2022 Dec;11(12):e12290. 工程化EV表面展示唾液酸化Lewis X(sLeX)、Lewis X(LeX)两类特征糖表位：sLeX通过识别内皮细胞表面E-selectin，介导EV靶向活化内皮；LeX借助结合DC-SIGN实现对树突状细胞的靶向递送。
图5：GalNac(N-乙酰半乳糖胺)修饰的红细胞衍生EV对肝脏疾病的保护作用
——Int J Nanomedicine. 2025 Jul 15:20:8993-9017.
外泌体形成和发挥功能的全程，其内部蛋白会发生多种翻译后修饰，不同修饰调控EV的识别、递送、货物分选与生物发生等关键环节。
外泌体表面糖基化修饰可参与调节其与受体细胞的识别、黏附和摄取，并可能影响其体内分布与清除行为。（Adv Drug Deliv Rev. 2025 Mar:218:115522.）
图6：糖基化对细胞外囊泡EV体内分布的调控作用
一项针对膀胱癌的研究发现，唾液酸化修饰（一种糖基化修饰）影响EV被受体细胞摄取，EV表面的整合素β1的唾液酸化糖修饰是调控EV被受体细胞摄取的关键因素，且能够在裸鼠模型中调控EV的促转移能力。（Cell Mol Biol Lett. 2024 Apr 1;29(1):46.）
图7：囊泡中整合素β1上的唾液酸化糖修饰决定EV内吞进入受体细胞
外泌体蛋白磷酸化情况常可反映来源细胞的状态，例如增殖、炎症、应激、迁移、代谢重编程或肿瘤恶性进展。
磷酸化既能够影响外泌体的生成与释放进程，还可借助在细胞之间转运激酶、磷酸酶参与细胞通讯。
比如从阿尔茨海默病患者脑组织、表达人突变tau的转基因小鼠中分离得到的EV，其内部存在发生磷酸化、折叠错误的tau蛋白（Brain. 2021; 144:288-309）；高度磷酸化的tau会错误富集在树突以及突触后区域，最终造成突触功能受损（Autophagy. 2018; 14:2139-2154）。最近一项发表在《Cell》杂志上的重磅研究表明，Arc将具备病理播种活性的tau打包进神经元EV、促进tau向外分泌，由此完成tau病理的细胞间传递。值得注意的是，阿尔茨海默病患者脑组织EV中Arc蛋白含量与磷酸化tau(AKT8)蛋白水平存在相关性。这提示我们磷酸化修饰蛋白可通过EV在细胞间水平传递。
图8：Arc通过EV介导细胞间磷酸化tau(AKT8)的传递
在部分EV生物发生和货物分选过程中，蛋白泛素化可作为分选信号，被泛素识别蛋白及部分ESCRT相关分子识别，并参与内体运输、多泡体形成及货物进入EV的过程。（Cell. 2001 Jul 27;106(2):145-55.）
图9：蛋白泛素化修饰影响EV生物发生和货物分选
SUMO化修饰同样参与细胞外囊泡的生物发生和货物分选：一方面调控α-突触核蛋白分选进入细胞外囊泡（Acta Neuropathol. 2015;129(5):695-713.），另一方面影响特定miRNA向EV的装载。
图10：SUMO化调节α-突触核蛋白的EV分选
供体细胞和其EV的配对泛素化修饰组学/SUMO修饰组学分析，可用于探索：哪些蛋白获得泛素化/SUMO化分选信号、这些蛋白的EV装载效率是否发生变化，以及E3泛素连接酶、去泛素化酶、SUMO E2连接酶和ESCRT复合体等分子是否参与该过程。
注：EV中还存在其他修饰类型，篇幅所限，本篇暂不赘述。
开展传统修饰蛋白质组研究时，一般先将蛋白酶解为肽段，针对性富集携带目标修饰的肽段后开展质谱检测；同时平行完成无修饰富集步骤的常规蛋白组检测，两套数据互相配合，解析EV蛋白组成和各类蛋白的修饰类型以及修饰位点的丰度水平。
图11：EV修饰蛋白质组传统方法流程
——Trends Analyt Chem. 2018 Oct:107:21-30.
目标修饰肽段丰度偏低，PTM肽段富集操作过程伴随大量样品损耗，因此相比于常规蛋白质组研究，依赖于富集的传统修饰蛋白质组需要更多的蛋白起始量，根据不同类型修饰组学大概要求500μg-3mg不等的起始蛋白。
多数情况下，EV蛋白含量通常有限，且受样本体积/重量、分离方法、EV亚群组成及共分离蛋白背景影响显著。比如1mL血浆根据分离方法不同，EV得率约在10-100μg，纯化过程中去除的游离高丰度蛋白、脂蛋白颗粒越多，最终收获的EV蛋白量就越低。
因此，有限的起始样本量、较低的高纯EV提取得率以及PTM肽段富集过程中的样品损耗，共同构成EV修饰蛋白质组研究的主要样本量瓶颈。
EV中往往存在多种不同的PTM修饰，不同修饰之间可产生协同或拮抗的交叉串扰效应，甚至会在同一蛋白底物乃至同一位点形成竞争性修饰。
现阶段围绕外泌体开展的修饰组学研究尚且有限，研究者可以结合自身研究背景做多维度PTM修饰蛋白组分析，填补该领域的研究空白；同时从多类型PTM互相串扰的角度，更深入地解析疾病发生、发育进程、耐药性形成等背后的分子机制。
传统修饰组要针对每一类PTM分开富集纯化，想要同时检测多种修饰，就要分次消耗大量EV样品，所需起始蛋白量成几倍上涨，开展多类型PTM修饰蛋白质组更是难上加难！
图12：蛋白翻译后修饰PTM的致病机制与生物标志物开发，以及多修饰串扰
——MedComm (2020). 2026 Apr 12:7:e70729.
——解决EV低起始量蛋白和多类型修饰难题：
泛修饰蛋白质组学涵盖了各种传统的酶促翻译后修饰，以及氨基酸替换、非标准氨基酸引入、mRNA编辑或剪切导致的蛋白多态变化，以及代谢物、小分子与蛋白发生共价结合形成的化学衍生物修饰。
恩泽康泰可以提供依托于Exosupur®的高纯EV分离，Astral高深度蛋白质组技术，无需预先富集特定修饰肽段，适配于外泌体微量样本，无需预设PTM修饰类型无偏广筛已知和未知修饰的泛修饰蛋白质组学技术，详见《〈Science〉引领泛修饰蛋白质组学新技术，单次仅需20μg外泌体！》
图13：外泌体泛修饰组学技术流程图
由于技术较新，目前尚无应用外泌体泛修饰蛋白质组技术发表的文献。恩泽康泰基于2例血浆外泌体开展泛修饰蛋白质组学，实测结果显示：一共检出5375个蛋白，其中发生修饰的蛋白共计2402个；总共鉴定出574类修饰类型，其中尚未明确的未知修饰类型有67种。位列修饰蛋白数目排名Top30的PTM包含乙酰化（Acetyl）、磷酸化（Phospho）、甲基化（Methyl）、糖基化（HexN）等。
实测结果证明，起始量仅为20~50μg的外泌体蛋白（大概3~5mL血浆），就能够产出质量可观的泛修饰检测数据；上述这些翻译后修饰既有望调控外泌体蛋白的生物学功能，也可以作为后续筛选疾病候选标志物的优质靶点，当然您也可以着眼于新发现的修饰类型开展深度探索。
表1：血浆外泌体泛修饰组学实测数据展示
图14：外泌体泛修饰组学数据前30种修饰类型的蛋白质种类数目分布
不知不觉间，与大家分享了这么多内容，对外泌体泛修饰组学感兴趣的老师们，可以联系我们获取更多资料和研究方案。
4. 外泌体蛋白质组研究合集
