近日，中国农业科学院牧医所孙鹏研究员团队在微生物学著名期刊Microbiome（微生物学TOP，IF：14.9）发表了题为“Heat stress suppresses lactation through potential rumen-mammary communication mediated by extracellular vesicles: integrated analysis of microbiome, metabolome, and miRNA profiles”的研究文章。黄棋博士为论文第一作者，杜德伟、国佳和刘佳琪参与研究，孙鹏研究员为通讯作者。中国农业科学院北京畜牧兽医研究所畜禽营养与饲养全国重点实验室为论文唯一单位。其中，恩泽康泰提供了奶牛血浆外泌体和乳汁外泌体分离鉴定 & miRNA测序分析服务。
本研究以泌乳中期荷斯坦奶牛为研究对象，整合瘤胃宏基因组、代谢组以及血浆和乳汁来源细胞外囊泡小RNA测序，系统分析热应激条件下奶牛泌乳性能、瘤胃微生物、代谢稳态、屏障功能及细胞外囊泡信号的变化。结果表明，热应激不仅显著降低产奶量、乳脂和乳蛋白产量，还引起瘤胃微生物结构改变、碳水化合物降解能力下降、甲烷代谢增强、瘤胃代谢谱改变、屏障功能受损及全身炎症。与此同时，热应激显著改变血浆和乳汁细胞外囊泡的miRNA表达谱，相关miRNA可能通过调控MAPK、Wnt、Hippo、钙信号及激素相关通路，参与乳腺功能和乳成分合成的调节。该研究从“瘤胃微生物-代谢物-屏障与炎症-细胞外囊泡miRNA-乳腺功能”多个层面，构建了热应激抑制奶牛泌乳的潜在跨器官调控框架，为进一步解析瘤胃-乳腺通讯机制及开发奶牛热应激精准干预策略提供了新的理论基础。
Part1 研究背景
牛奶是膳食优质动物蛋白的关键来源。如今奶牛养殖趋于集约化高产模式，高产奶牛耐热性偏弱，叠加全球升温带来的高温频发问题，热应激严重制约奶业发展。热应激会扰乱奶牛呼吸、进食、内分泌与免疫状态，拉低产奶量以及乳脂、乳蛋白含量，单一的采食下滑、乳腺局部损伤无法完整解释该系统性损伤。
瘤胃作为反刍动物核心消化器官，其微生态失衡或是热应激损害泌乳功能的关键纽带，瘤胃-乳腺轴也因此得到学界关注。瘤胃菌群能够借助代谢产物、炎症介质等信号远程调控乳腺；瘤胃、肠道屏障破损后，菌群衍生物会入血诱发全身性炎症，干扰乳腺稳态。纳米级细胞外囊泡可搭载蛋白、脂质、miRNA 等活性组分完成远距离信号传递，微生物分泌的胞外囊泡同样有望突破屏障进入循环，介导瘤胃与乳腺的跨区域交流。
然而，热应激引起的瘤胃微生物和代谢变化是否与循环及乳汁细胞外囊泡miRNA改变相关，以及这些变化是否共同参与乳腺功能和乳成分合成的调控，仍缺乏系统研究。基于此，研究团队提出假设：热应激通过改变瘤胃微生物组成和代谢功能，造成发酵紊乱、屏障损伤及全身炎症，并进一步改变血浆和乳汁细胞外囊泡miRNA表达谱，这些变化可能共同参与瘤胃与乳腺之间的跨组织通讯，最终抑制乳脂、乳蛋白及乳产量。
Part2 研究方法
图1 奶牛热应激诱导的实验设计和环境温湿度监测
奶牛试验设计与样品采集
研究选取30头健康的泌乳中期荷斯坦奶牛，根据自然环境温湿度指数(Temperature-Humidity index，THI)，将奶牛分为热中性组（CON group）和热应激组（HS group），每组15头。CON组在温湿度指数THI低于68的条件下采样，HS组在自然夏季温湿度指数THI大于68的条件下采样。两组奶牛饲喂相同全混合日粮，并采用一致的饲养管理方式。试验期间采集瘤胃液、血浆和乳汁样品，并记录奶牛泌乳性能及生理指标。
泌乳性能、瘤胃发酵和血浆指标检测
研究测定了产奶量、乳脂、乳蛋白、乳糖、总固形物、乳尿素氮、能量校正乳及乳脂校正乳等指标，同时监测直肠温度(rectal temperatures，RTs)和呼吸频率(respiratory rates, RRs)。瘤胃液用于检测pH、总挥发性脂肪酸及乙酸、丙酸、丁酸和戊酸等发酵参数。血浆中检测皮质醇、HSP27、HSP70、HSP90、HSF1等热应激指标，以及IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α、D-乳酸和脂多糖等炎症与屏障功能相关指标。
瘤胃宏基因组测序
利用宏基因组测序分析瘤胃微生物的变化，通过KEGG、碳水化合物活性酶数据库及COG数据库，对微生物代谢通路、碳水化合物降解酶及功能基因进行注释。进一步结合差异微生物、差异功能通路、瘤胃发酵指标和泌乳性能开展相关性分析，筛选可能参与热应激性泌乳抑制的关键微生物及其功能。
瘤胃非靶向代谢组学分析
采用超高效液相色谱串联质谱开展瘤胃液非靶向代谢组学分析，比较CON组和HS组的代谢谱，并对差异代谢物进行KEGG数据库注释、通路富集和来源追踪，并分析关键代谢物与瘤胃微生物和泌乳性能之间的关系。
血浆和乳汁细胞外囊泡富集与表征
研究采用尺寸排阻色谱SEC联合超滤的方法(Exosupur® ES9P11e)，分别从血浆和乳汁中富集细胞外囊泡。通过透射电镜观察囊泡形态，利用纳米流式细胞仪检测粒径分布和颗粒浓度，并通过Western blot检测细胞外囊泡标志蛋白。
细胞外囊泡miRNA测序及整合分析
对30个血浆和乳汁来源细胞外囊泡分别进行小RNA测序，筛选差异miRNA，并采用qRT-PCR对部分候选miRNA进行验证。通过靶基因预测、GO和KEGG富集分析、蛋白质互作网络及miRNA-mRNA共表达网络，解析差异miRNA可能参与的生物学功能，并结合瘤胃微生物和代谢组数据探索潜在的瘤胃-乳腺通讯信号。
Part3 主要研究结果
1. 热应激显著降低产奶量、乳脂和乳蛋白产量
与CON组相比，HS组奶牛的直肠温度由38.72℃升高至39.16℃，呼吸频率由49.42次/min升高至61.44次/min，表明试验奶牛已产生明确的热应激生理反应。热应激使奶牛日产奶量由45.50 kg下降至36.74 kg，下降幅度达到19.25%。与此同时，乳脂率由3.63%下降至3.13%、乳蛋白率由3.24%下降至3.03%，总固形物含量也显著降低。除乳成分含量下降外，热应激组的乳脂产量、乳蛋白产量、乳糖产量、能量校正乳产量及4%乳脂校正乳产量均显著降低。乳尿素氮则明显升高，提示热应激可能同时影响奶牛氮代谢及氮利用效率。这些结果说明，热应激不仅减少产奶量，还同步降低乳脂和乳蛋白合成效率。
2. 热应激破坏瘤胃发酵，并诱发屏障损伤和全身炎症
热应激组奶牛瘤胃pH由6.36下降至6.09，总挥发性脂肪酸浓度由136.84 mmol/L下降至110.04 mmol/L，降幅达到19.58%。其中，丁酸比例由10.42%下降至8.16%，戊酸比例由1.36%下降至1.04%。挥发性脂肪酸是反刍动物最重要的能量来源之一，丁酸还参与瘤胃上皮健康和乳腺脂质合成。总挥发性脂肪酸及丁酸下降，说明热应激降低了瘤胃发酵效率，并可能限制乳腺合成乳脂和乳蛋白所需的能量及代谢底物。
血浆检测显示，热应激显著升高皮质醇、HSP27、HSP70、HSP90和HSF1水平，反映机体应激反应被充分激活。热应激组促炎细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α显著升高，而抗炎因子IL-10显著下降。同时，血浆D-乳酸和脂多糖水平明显升高，提示瘤胃或肠道屏障完整性可能受损，微生物来源成分进入循环的风险增加。
相关性分析发现，乳脂产量、乳蛋白产量和能量校正乳产量与瘤胃pH、丁酸、戊酸和IL-10呈正相关，而与热休克蛋白、促炎细胞因子、D-乳酸和脂多糖呈负相关。这表明热应激性泌乳下降不仅与营养底物供应不足有关，还可能与屏障损伤和系统性炎症密切相关。
图2. A-B 泌乳性能与奶牛在热应激下的生理、瘤胃发酵、炎症和屏障相关指标的关联分析
（A）关键泌乳性状（乳脂产量，乳蛋白产量，ECM产量）与生理，瘤胃和炎症指标之间的Spearman相关分析。（B） Mantel测试评估泌乳性状与生理，瘤胃和炎症变量之间的全球关联。
3. 热应激显著改变瘤胃微生物的组成与结构
宏基因组分析显示，奶牛瘤胃微生物主要由细菌组成，优势菌门为Bacteroidota和Bacillota，Prevotella是相对丰度最高的菌属。虽然细菌、古菌、病毒和真核微生物在结构域水平的总体比例未发生显著改变，但热应激明显改变了细菌和古菌的群落结构，说明热应激对瘤胃微生物的影响主要体现在具体类群及其群落平衡的改变，而不是简单改变不同微生物结构域的总体占比。在物种水平，CON组富集了19个细菌物种，其中Prevotella具有较强的碳水化合物和蛋白质降解能力，并参与丙酸及微生物蛋白生成；Bifidobacterium和Lactobacillus则与挥发性脂肪酸生成、屏障稳态和免疫调节有关。相关性分析发现，Lactobacillus acetotolerans及多种Prevotella物种与乳脂产量、乳蛋白产量和能量校正乳产量均呈正相关。相比之下，HS组富集了24个细菌物种。Pseudobutyrivibrio ruminis、Aristaeella hokkaidonensis、Aristaeella lactis、Acetatifactor sp.、Mycoplasma sp.、Saccharofermentans sp.及Sodaliphilus pleomorphus等热应激条件下富集的细菌，与三项主要泌乳指标均呈负相关。这些结果提示，热应激使瘤胃微生物由更有利于营养降解、挥发性脂肪酸生成和泌乳的群落状态，转向与低效发酵及泌乳下降相关的微生物结构与组成。
图2. C-D 奶牛瘤胃宏基因组分析结果
（C）线性判别分析效应大小（LEfSe）识别CON和HS组之间的差异细菌种类（LDA > 2, P <0.05). （D） Spearman相关分析差异富集细菌物种的相对丰度与泌乳性能参数之间的相关性，包括乳脂产量，乳蛋白产量和ECM产量。
4. 热应激使瘤胃微生物功能由高效营养利用转向甲烷和低效能量代谢
KEGG功能分析显示，CON组瘤胃微生物的碳水化合物代谢和其他次级代谢物生物合成功能更加活跃，而HS组则表现出能量代谢和甲烷代谢增强。碳水化合物活性酶分析也显示，CON组富集了更多参与复杂碳水化合物降解的糖苷水解酶和多糖裂解酶，说明其瘤胃微生物具有更强的日粮纤维和多糖降解潜力。甲烷代谢是唯一一个与乳脂产量、乳蛋白产量和能量校正乳产量均呈负相关的微生物功能通路。该通路与多种热应激富集菌呈正相关，而与Lactobacillus acetotolerans等CON组富集菌呈负相关。甲烷代谢增强意味着更多发酵底物可能以宿主无法利用的形式损失。同时，碳水化合物降解、氨基酸代谢及微生物蛋白合成功能下降，可能进一步减少用于乳糖、乳脂和乳蛋白合成的营养物质。
因此，热应激对瘤胃微生物的影响不仅是“组成发生改变”，更重要的是引起了微生物代谢功能重新分配，使瘤胃发酵由高效营养转化逐渐转向能量损失和低效利用。
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5. 热应激显著改变瘤胃代谢谱
代谢组学共鉴定出1,658种瘤胃代谢物。PCA、PLSDA、OPLSDA显示CON组与HS组具有明显不同的瘤胃代谢特征，共计610种显著差异代谢物，其中258种在HS组升高，352种在HS组降低。差异代谢物主要涉及次级代谢产物生物合成、氨基酸代谢、脂质代谢、化学结构转化及外源物降解等功能。代谢通路分析显示，氨基苯甲酸降解和色氨酸代谢发生显著改变，提示热应激可能同时影响微生物代谢、氨基酸利用及宿主-微生物互作过程。
为了进一步确定差异代谢物的来源，研究团队采用MetOrigin进行代谢物溯源。结果显示，43种差异代谢物主要来源于宿主，100种主要来源于微生物，35种属于宿主与微生物共同代谢产物，其余代谢物可能来自日粮、环境或未知来源。在VIP值最高的前100种代谢物中，有23种CON组富集代谢物与乳脂产量、乳蛋白产量和能量校正乳产量均呈正相关。这些代谢物大多同时与Lactobacillus acetotolerans和多种Prevotella呈正相关。相反，有58种热应激组富集代谢物与三项泌乳指标呈负相关，并与Acetatifactor、Mycoplasma等热应激富集菌呈正相关。
该结果在瘤胃微生物变化与泌乳表型之间建立了代谢层面的联系，说明热应激引起的微生物群落改变能够进一步改变瘤胃代谢，进而影响宿主可利用的能量、氨基酸和脂质代谢底物。
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6. 热应激显著改变血浆来源细胞外囊泡miRNA表达谱
透射电镜观察显示，血浆来源细胞外囊泡呈现典型的杯状结构。Western blot检测到TSG101、Alix和HSP70等细胞外囊泡标志蛋白，且未检测到阴性标志蛋白Calnexin，表明血浆细胞外囊泡得到有效富集。纳米流式分析发现，与CON组相比，HS组血浆细胞外囊泡的平均粒径和中位粒径显著减小，但颗粒浓度没有显著变化。研究对60份血浆和乳汁细胞外囊泡样品开展小RNA测序，共鉴定出1,924个miRNA，包括784个已知miRNA和1,140个新预测miRNA。
在血浆细胞外囊泡中，HS组与CON组的miRNA表达谱明显分离，共筛选出172个差异已知miRNA，其中8个上调、164个下调；同时发现340个差异新miRNA，其中339个下调。qRT-PCR验证结果与测序变化趋势一致，表明测序数据具有较好的可靠性。差异已知miRNA的靶基因主要富集于MAPK、Wnt、Hippo、钙信号和激素调控等通路。这些通路参与细胞增殖、分化、凋亡、应激适应、免疫反应及物质代谢，提示热应激可能通过改变循环细胞外囊泡miRNA，对包括乳腺在内的远端组织产生系统性影响。
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7. 热应激显著改变乳汁来源细胞外囊泡miRNA表达谱
乳汁来源细胞外囊泡同样呈现典型杯状结构，粒径主要分布在40～200 nm，并表达TSG101、Alix、CD81和HSP70等标志蛋白。热应激并未显著改变乳汁细胞外囊泡的平均粒径和中位粒径，但显著增加了粒径离散程度和颗粒浓度。
小RNA测序显示，热应激组乳汁细胞外囊泡中共有473个差异已知miRNA，其中41个上调、432个下调；另有835个差异新miRNA，其中24个上调、811个下调。与血浆细胞外囊泡相似，乳汁细胞外囊泡中的大多数差异miRNA也表现为下调，说明热应激可能对细胞外囊泡介导的转录后调控网络产生广泛抑制或改变作用。乳汁差异miRNA的预测靶基因主要富集于细胞骨架、激素信号、MAPK、Wnt和Rap1等通路。乳汁细胞外囊泡被认为能够在一定程度上反映乳腺局部细胞的生理状态，因此这些变化提示热应激可能通过调节乳腺细胞增殖、屏障结构、免疫稳态以及乳脂和乳蛋白合成相关信号，直接影响乳腺泌乳功能。
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8. 血浆和乳汁细胞外囊泡中95个共同变化miRNA构成潜在跨组织信号
为了筛选可能参与瘤胃-乳腺跨组织通讯的核心信号，研究团队进一步比较了血浆和乳汁细胞外囊泡中的差异miRNA。结果发现，热应激条件下共有95个已知miRNA在血浆和乳汁细胞外囊泡中呈现一致的差异变化，其中1个共同上调，94个共同下调。这些共同变化miRNA与多种热应激差异瘤胃细菌存在显著相关关系，提示热应激引起的瘤胃细菌变化可能与宿主细胞外囊泡miRNA表达改变相联系。
靶基因功能分析显示，这95个共同miRNA涉及448个显著富集的GO条目和142条KEGG通路，主要包括MAPK、Wnt、Hippo、钙信号、激素调控和细胞骨架等。进一步构建的蛋白质互作网络包含716个节点和2,833条相互作用关系。通过MCODE和CytoHubba两种算法交集筛选，最终确定26个关键枢纽基因，包括CREB/ATF家族成员、PKA相关基因、MAPK家族成员和钙信号相关基因。这些基因与甲状腺激素、生长激素、催产素、胰岛素分泌和促性腺激素释放激素等信号有关，并可能共同调控乳腺上皮细胞的增殖、分化、凋亡、紧密连接、免疫反应、脂肪酸代谢和蛋白质合成。
因此，这95个共同变化miRNA可能构成连接全身循环信号与乳腺局部响应的重要候选分子，为细胞外囊泡参与瘤胃-乳腺通讯提供了新的分子线索。需要强调的是，本研究发现的是血浆和乳汁细胞外囊泡中的共同miRNA信号及其与瘤胃菌群的相关关系，尚不能证明这些miRNA直接来源于瘤胃，也不能证明其已经完成由瘤胃向乳腺的定向运输。其真实来源、转运轨迹和功能仍需通过细胞外囊泡标记示踪及功能试验进一步验证。
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9. 热应激进一步增强血浆与乳汁细胞外囊泡miRNA的组织差异
研究团队进一步比较了同一环境条件下血浆和乳汁细胞外囊泡的粒径及miRNA表达特征。无论在热中性还是热应激条件下，血浆细胞外囊泡的平均粒径、中位粒径和粒径变异程度均高于乳汁细胞外囊泡，但其颗粒浓度低于乳汁细胞外囊泡，说明两类体液中的细胞外囊泡具有明显不同的来源和生物学特征。在热中性条件下，血浆和乳汁细胞外囊泡之间存在543个差异已知miRNA；在热应激条件下，两者之间的差异miRNA数量增加至614个。其中，162个miRNA仅在热应激条件下表现出血浆与乳汁之间的差异，提示热应激不仅改变单一组织中的miRNA表达，还可能进一步改变循环系统与乳腺局部之间的信号分布。此外，有452个miRNA在热中性和热应激条件下均表现出稳定的血浆-乳汁差异，反映了血浆和乳汁细胞外囊泡固有的组织特异性。
这些结果说明，细胞外囊泡miRNA既包含相对稳定的组织来源特征，也包含对热应激作出响应的动态信号，为区分组织特异性miRNA和潜在跨组织共享miRNA提供了依据。
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Part4 研究结论
本研究通过整合奶牛泌乳表型、瘤胃宏基因组、瘤胃代谢组以及血浆和乳汁细胞外囊泡miRNA组学，系统揭示了热应激抑制奶牛泌乳所涉及的多层级变化。首先，热应激显著升高奶牛体温和呼吸频率，并降低产奶量、乳脂、乳蛋白及能量校正乳产量。其次，热应激破坏瘤胃发酵环境，使总挥发性脂肪酸、丁酸和戊酸下降，同时伴随屏障功能受损、脂多糖进入循环及全身炎症增强。在微生物层面，热应激降低多个Prevotella、Bifidobacterium及Lactobacillus相关物种的丰度，并富集多种与泌乳性能负相关的细菌。微生物功能由碳水化合物高效降解和营养底物生成，转向甲烷代谢增强和低效能量利用。瘤胃代谢组结果进一步表明，菌群变化可伴随氨基酸、脂质及宿主-微生物共同代谢物的改变，进而减少乳腺合成乳脂和乳蛋白所需的营养及代谢前体。与此同时，热应激显著改变血浆和乳汁细胞外囊泡的粒径、浓度和miRNA表达谱。血浆和乳汁中共同变化的95个miRNA可能通过MAPK、Wnt、Hippo、钙信号和激素相关通路，影响乳腺上皮细胞增殖、分化、凋亡、屏障稳态、免疫调节及泌乳功能。综合来看，本研究提出了如下潜在机制：热应激首先引起瘤胃微生态失衡和代谢改变，导致发酵效率下降、营养底物供应不足及屏障功能损伤；微生物及其相关组分、代谢物和炎症信号进入循环后，可能进一步改变宿主细胞外囊泡的miRNA表达谱；这些细胞外囊泡相关信号通过循环和乳腺局部调控网络影响乳腺功能，最终造成乳脂、乳蛋白和乳产量下降。该研究揭示了热应激条件下瘤胃微生物调控远端乳腺功能的新视角。基于该研究发现，后续可通过靶向关键瘤胃微生物、优化肠道屏障功能、调控细胞外囊泡miRNA信号开发新型干预策略，为缓解热应激造成的泌乳性能损失、提升高产奶牛热环境适应能力提供了重要理论依据与新方向。
论文引用
Huang Q, Du D, Guo J, Liu J, Sun P. Heat stress suppresses lactation through potential rumen-mammary communication mediated by extracellular vesicles: integrated analysis of microbiome, metabolome, and miRNA profiles. Microbiome. 2026;14:124. doi: 10.1186/s40168-026-02363-3.
写在最后
恩泽康泰于2024年依托于以往的项目经验和专研的研发结果，宣布可以大规模承接禽畜EVs研究项目，详见《恩泽康泰进军家畜外泌体研究领域——全面解锁猪/牛/羊/鸡外泌体研究》。时至今日，在禽畜EVs研究方面，恩泽康泰助力成果交出了一份份满意答卷，比如本篇研究和如下所示研究，恩泽康泰将继续努力开发好的产品、提供优质的服务，争取助力更多客户完成禽畜领域EVs研究。
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