国际细胞外囊泡协会（ISEV）建议的最小实验要求（MISEV2023）中，关于基于商业化试剂盒分离EV的建议如下：

基于沉淀法原理的试剂盒会将所有EP浓缩在混合物中，甚至是许多游离蛋白，从而产生高度不纯的制剂，尤其是来自复杂的富含NVEP的来源，如血浆和血清，除非仅为了减少体积(浓缩)，否则强烈不建议使用此类试剂盒。



分子尺寸排阻色谱法SEC原理：生物流体样品加入含有具有固定孔隙的SEC填充材料的排阻柱中，粒径较小的分子如蛋白、脂类等可进入填充材料的固定孔隙，而较大粒径的分子或颗粒不能进入孔隙只能进入填充材料间隙。因此加入缓冲液的作用下，较大粒径的囊泡因只能进入材料间隙流速快在前面的馏分中被洗脱，而小分子杂质则需要更长的洗脱时间才能流出，从而实现EV的分离。



分子尺寸排阻色谱法SEC在诸多分离方法中综合性能较高，并且使用频次仅次于超离，在EVs专刊JEV中的研究占比日益提高。



Exosupur^®血浆/血清 sEV纯化试剂盒即是基于SEC方法开发的，针对血浆/血清等成分复杂体液样本的sEV外泌体专用分离纯化试剂盒。

1. 1ml和微量排阻柱分别适用于常量或微量血浆/血清等复杂生物样本；

2. 分离的复杂生物样本来源sEV纯度更高，杂质干扰更少，适用于高通量测序、质谱等组学研究，以及下游的PCR、WB、WLISA验证等表达定量研究，定量更准确；

3. 通过本试剂盒分离复杂生物样本来源sEV，方法温和简单，不影响外泌体性质和活性、不引入聚集和其他杂质等影响，可用于细胞、动物的功能机制研究实验；

4. 复杂样本sEV纯化相关的方法学开发中，本试剂盒可作为对照方法使用。

1. 操作简便：无需特殊设备，柱平衡、上样、外泌体收集、外泌体浓缩4步操作，从上样到分离完成仅需30-60min；

2. 性能优越：对于常量血浆样本Exosupur^®1ml血浆/清排阻柱可回收最高达95%的荧光脂质体，杂蛋白去除率高达99.5%；微量血浆/清排阻柱可回收高达94%纳米颗粒，杂蛋白去除率平均为98%；

3. 稳定性高：只回收固定尺寸范围的外泌体，产物粒径范围窄；实验受外界因素波动的影响比较小；不引入其他的物理(如超离的超高速离心力)和化学因素（如沉淀法的PEG颗粒），可以保持完整的外泌体形态和功能；

4. 性价比高：通过对排阻柱进行清洗再生，可重复使用5次，即单根排阻柱可处理5个样本；

5. 质量可靠：Exosupur^®系列sEV纯化试剂盒高效便捷，已辅助客户发文100篇+，不乏IF 10以上的高质量文献，经受了行业专家的检验，获得北京市新技术新产品认定。

1、Exosupur^®血浆排阻柱分离血浆外泌体的各项性能数据

Exosupur^®分离的血浆或微量血浆小细胞外囊泡sEV TEM电镜、WB和nanoFCM粒径表征。

Exosupur^®1ml血浆/清排阻柱对于血浆样本可回收最高达95%的荧光脂质体，杂蛋白去除率高达99.5%；微量血浆/清排阻柱可回收高达94%纳米颗粒，杂蛋白去除率平均为98%；

下左图为1ml血浆/清排阻柱(ES9P14e、ES9P11e)分离1mL血浆sEV效果，下右图为微量血浆/清排阻柱(ES9P021e、ES9P024e)分离0.2mL微量血浆sEV的效果。

下第2排图片，Western Blot中可以看出血浆中主要的miRNA结合蛋白更少，杂蛋白更少。高纯度外泌体更有利于RNA组学、蛋白组学及细胞功能学和在体实验研究。

2、Exosupur^®血浆排阻柱与其他原理血浆外泌体分离试剂盒---竞品分析

使用Exosupur^®血浆排阻柱和2种不同原理（膜亲和法Kit-Q和沉淀法Kit-S）的市售血浆外泌体分离试剂盒，以及经典的超离，分离血浆外泌体检测各项指标，结果如下：

分离的血浆sEV通过WB等蛋白上样检测血液中主要的污染蛋白：白蛋白HSA和RNA结合蛋白Ago2、脂蛋白ApoB，结果显示Exosupur^®分离的外泌体杂质蛋白含量更低。（原理为沉淀法的Kit-S分离的血浆外泌体相对纯度更差一些）

1ml血浆分离sEV通过NanoFCM检测粒径分布和颗粒数，结果显示Exosupur^®分离的血浆EV尺寸分布相对较窄为小囊泡，颗粒数得率适中。（原理为沉淀法的Kit-S分离的血浆外泌体尺寸相对大一些，得率最高）

通过分离的血浆sEV particle数与蛋白含量比值评估外泌体纯度，结果显示Exosupur^®分离的外泌体纯度更高，杂蛋白含量更低。

数据来自于J Transl Med. 2021 Mar 12;19(1):104. 

对于低表达量的长RNA， Exosupur^®能够得到更高丰度的长链RNA，更有利于mRNA + LncRNA研究。

数据来自于J Transl Med. 2021 Mar 12;19(1):104. 

对于miRNA，由于Exosupur^®富集的外泌体得率更高、纯度更高，使得富集于sEV的miRNA定量值更高，而非富集miRNA定量值非常低，能够更准确分析sEV来源miRNA。

数据来自于J Transl Med. 2021 Mar 12;19(1):104. 

Protein K和RNase A双酶消化进一步证实了Exosupur^®得到的RNA更多的是来源于囊泡，而囊泡外的游离RNA检测值更低。

Exosupur^®分离的外泌体进行蛋白质组研究时，可检测到丰富的囊泡特异的标志物蛋白，表明外泌体纯度高，可以更多检测外泌体来源的蛋白；可检测到比较多的蛋白数量，有利于不同样本之间的差异分析；与已发表文章、数据库具有较多overlap，表明数据可靠，能够准确的对外泌体蛋白进行研究。

3、Exosupur^®血浆排阻柱与同SEC原理的血浆外泌体排阻纯化试剂盒---竞品分析

经过Exosupur^®试剂盒收集的馏分，具有最高的particles荧光强度(即颗粒浓度)和最低的蛋白质浓度（A和B），Particles/protein纯度指标最高（C），表明Exosupur^®具有最有效的EVs回收率和最低的游离蛋白质污染、分离的EVs纯度最高。

                      注：蛋白含量通过 BCA 法测定，particles颗粒数量通过检测 A480 值来确定。D和E图：使用ES9P11e分离的血浆、尿液和细胞上清来源外泌体的电镜TEM和WB表征结果。

Q：该试剂盒分离外泌体需要自备的内容有哪些？

A：

1．无菌PBS溶液(须用0.22μm滤膜过滤，建议新鲜配置或采购已过膜的PBS，4°C冰箱保存的PBS溶液需先平衡至室温)；

2．20%无水乙醇(须超声条件脱气20min或配置好后静置过夜)；

3．超滤管(截留分子量100kD)；

4．收集管(1.5mL EP管和15mL离心管)；

5．样品(上样前需平衡到室温，单根柱子单次上样体积为1mL)。

Q：如果是0.5ml左右的血浆样本应该用哪一款试剂盒？

A：直接稀释到1ml上样到Exosupur^® ES9P11e/ES9P14e 1ml血浆排阻柱

Q：Exosupur^® 微量血浆/清排阻柱的上样0.2ml指的是原始血浆/血清吗？

A：指的是经过低速离心和过0.45 μm滤膜处理后的样本，0.2ml。请注意滤膜过滤会损失约100 μl。如果只用0.2ml血浆进行滤膜过滤建议客户再用约100 μl PBS进行二次过膜润洗。

Q：样本收集完了，颜色还在中间，是否有问题？

A：按照操作说明来做，就没问题，一般是颜色滞后，因为颜色都是小分子成分，会靠后出来，外泌体会先流出，故不能以颜色作为外泌体收集的判断。

Q：用完了是直接用封闭液冲洗，还是2部体积的PBS冲了再用1倍体积封闭液冲？

A：如果本次接着用就不用封闭液清洗；如果本次不用了，需保存起来下次用，那么本次就用PBS冲洗后再封闭液冲洗。

Q：分离后的外泌体如何保存
A：外泌体保存问题跟分离方法无关，是由其本身特性决定的，如果条件允许最好使用新鲜的外泌体进行实验，冻存的外泌体容易产生团聚并出现沉淀。实际研究中，外泌体功能实验往往需要大量的外泌体不得不分批提取保存时可-80℃保存；但做biomarker研究时，如RNA组学等，提取外泌体后需尽快完成RNA提取等后续实验。

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