组织外泌体研究聚焦于特定组织来源的细胞外囊泡EVs，从组织层面为深入了解EVs的功能和应用提供了独特视角。目前组织来源EVs研究主要聚焦于：1）联合体液外泌体筛选疾病特异性EVs标志分子；2）组织EVs介导的组织损伤修复、致病机制以及器官间通讯研究；3）将易获取的组织EVs作为工程化EVs原料进行小分子、小核酸、多肽等货物装载递送。

组织EVs的分离相较于细胞上清和体液等样本存在很多难点，本试剂盒专门用于解决各类新鲜组织来源EVs的高效分离纯化，例如肿瘤组织、心脏组织、脑组织、肺组织、肝组织、肠道组织、肾脏组织、脾脏组织、肌肉组织等，得到的组织EVs 可用于电镜TEM、nanoFCM/RPS/NTA粒径分析、核酸分析、蛋白分析、细胞实验和动物实验等。

• 本试剂盒专门用于解决各类新鲜组织来源EVs的高效分离纯化，例如肿瘤组织、心脏组织、脑组织、肺组织、肝组织、肠道组织、肾脏组织、脾脏组织、肌肉组织等。

•  如外泌体电镜效果不佳，或想要更高纯度的外泌体，4.6步得到的上清液（组织EVs粗提物）可进行分子尺寸排阻色谱(推荐Exosupur® ES9P11e)或者进行100,000 g以上超高速离心再次纯化。

1、主要的试剂EMix和bufferPI均为进口试剂，是经过恩泽康泰多年组织外泌体分离服务验证过的试剂；

2、EMix溶液：多种解离酶混合液，可温和且快速地解离各类组织；

3、bufferPI ：为组织裂解产物提供外泌体样本保护，避免外泌体降解。

4、配备了过滤组织解离残渣的70μm滤膜，初步去除细胞及大的细胞碎片。

5、试剂盒中配备的外泌体分离试剂，基于自主专利开发(专利号:ZL201811302563.0)，可快速、高效完成外泌体的分离，可用于基本表征分析、核酸分析、蛋白分析、细胞实验和动物实验等，也可进一步结合排阻或超离等方法进行高纯度组织外泌体分离。

使用本试剂盒对冻存的肾脏组织和肿瘤组织进行EVs纯化，结果如下所示：

建议使用新鲜组织分离得率更高、效果更好：活体取材后立即剔除结缔组织和脂肪组织等非研究所需的组织类型，使用预冷的无菌PBS或生理盐水清洗血水污渍等，用无菌纱布/吸水纸等吸干表面的液体。如果暂时不处理，请将组织于4℃短暂保存，保存时间不宜超过6-8h。

如外泌体电镜效果不佳，或想要更高纯度的外泌体，4.6步得到的上清液（组织EVs粗提物）可进行分子尺寸排阻色谱(推荐Exosupur® ES9P11e)或者进行100,000 g以上超高速离心再次纯化。推荐组合：ES9T-02 + ES9P11e。

1.               如何判断组织解离时孵育时间是否合适？

不同组织的硬度和细胞外基质（ECM）含量不同，会影响解离时间。像肝脏、脾脏等软组织，细胞外基质相对较少，解离时间较短，按照说明书中建议的15min即可。而肌肉、纤维结缔组织等硬度大、细胞外基质丰富的组织，解离时间可适当延长到20min。以显微镜下细胞呈单分散状态、无明显团块（说明解离较充分），且细胞活性不受影响为宜(活细胞率>80%，说明没有过度解离)。

2.               加入A液和B液混匀后，4℃静置孵育最长多久？

建议12h起，但不建议超过24h。

3.        孵育过夜离心之后无沉淀，这个现象正常吗？

由于某些组织的解离上清外泌体含量比较低，加了A液和B液离心之后肉眼无法观察到沉淀，建议：a.离心前根据离心后外泌体所在大致位置进行标记，以便后续弃去上清时减少损失。b.离心后在重悬时使用 PBS仔细吹打离心管壁四周和底部；提取后的外泌体应先进行 NTA/NanoFCM 颗粒浓度或 BCA 蛋白定量检测，再决定是否进行后继实验。

详情见：https://www.mybeckman.cn/resources/technologies/centrifugation/principles/rotor-types。

4.        提取外泌体时离心机离心力达不到10000g？

建议离心力可以减少到6000g并4℃离心60min。时间的减少或者离心力的降低对于回收率有一定的影响，可以根据自己样本情况，进行评估。

5.        重悬体积只能是初始上清的 1/20-1/30 吗？

不建议浓缩倍数太高的原因是，重悬时难以溶解，如果后续进行Exosupur®分离时可能会堵塞排阻柱导致流速较慢。若上清较稀（颗粒或BCA浓度较低），可使用初始上清的1/30体积PBS重悬，后续Exosupur®分离时上样建议颗粒浓度＞5E+10 particles/mL以提高排阻收率。

6.        外泌体重悬时沉淀较难溶解？

出现这种情况可能是上清浓度较高，浓缩倍数过大造成。建议先加入少许体积如0.14 mL，反复吹打尝试溶解，溶解后再补至需求体积吹打混匀，仍存在未完全溶解的现象时建议可室温静置30min后再次重悬，为增加得率尽可能混匀。

如上述操作后上清液中仍有大量沉淀可离心多次至无明显沉淀，每次取离心上清液于新离心管中。

7.        组织EVs粗提物使用分子尺寸排阻色谱SEC法进一步纯化，按照Exosupur®说明书进行操作吗？

m  单管EVs粗提物进行后续SEC纯化，需要先用PBS稀释到1ml，按照ES9P11e说明书进行操作。

m  如果提取了相同样本的多管组织EVs粗提物，多管可合并，合并后如不足1ml用PBS稀释到1ml，按照ES9P11e说明书进行操作。

SEC纯化出来的外泌体(合并建议收集的馏分)进行超滤浓缩时建议用PBS清洗2遍，即将馏分转移至超滤管先浓缩到所需体积，然后再补PBS至4mL，吹打外泌体进行清洗，4000g离心，重复清洗2次，最后离心至所需体积。（离心时间根据样本浓度而异，一般5-10min）

Exosupur组织外泌体分离纯化试剂盒说明书页-ES9T-01.pdf

Exosupur组织外泌体分离纯化试剂盒说明书页-ES9T-02.pdf