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外泌体鉴定即外泌体表征,主要是为了证明分离获得的细胞外囊泡是外泌体,具有外泌体的结构特征,粒径特征和蛋白marker。MISEV2018提示了外泌体研究最基本的实验,其中外泌体的表征主要分为两部分:总体水平表征外泌体标志蛋白和单囊泡水平表征外泌体拓扑结构和粒径;目前文章发表最常用的外泌体表征3项包括WB表征外泌体标志蛋白,电镜表征外泌体形态特征和纳米流式表征外泌体粒径特征。
外泌体表征:电镜
通过透射电子显微镜(TEM)观察法在高倍放大下直接观察单个外泌体的形态结构和大小,从而对外泌体的形态和大小进行鉴定;同时还可以根据背景的干净程度评估外泌体的纯度,是外泌体表征的金标准。
外泌体表征:粒径分析
纳米流式检测技术(NanoFCM)是在细胞流式的基础上开发的纳米级流式技术,无需标记即可在单囊泡水平实现外泌体的直接检测,可以检测低至30 nm 的外泌体的散射光信号;荧光通道可以实现单个藻红蛋白分子的检测,并与背景完全区分开。通过数据分析可直接获得外泌体的粒径和浓度信息,同时可以检测单个外泌体颗粒的内源性或外源标记的荧光信号。
外泌体鉴定:WB
WB是经典的研究蛋白表达的实验手段。基于外泌体的生物学生成方式和前期研究,外泌体具有一些认可度高的的marker蛋白;通过比较混合细胞与外泌体的marker蛋白和阴性蛋白的表达差异,证实分离获得的囊泡高表达外泌体marker蛋白。